近日，我所生物技術研究部分子探針與熒光成像研究組（1818組）徐兆超研究員團隊發(fā)展雙色單分子閃爍比率成像技術（2C-SMBR），在單溶酶體水平同步實現(xiàn)納米級結構成像與腔內pH準確定量。

溶酶體作為細胞的“化工廠”與“信號樞紐”，其功能高度依賴于腔內pH的精確調控。傳統(tǒng)觀點認為，溶酶體是均質的酸性細胞器（pH=4.5至5.0），然而，近年研究提示其存在功能異質性。例如，黑色素細胞中的黑素體、免疫細胞中的分泌性溶酶體均具有獨特的pH特征，甚至同一細胞內的經典溶酶體也可能因空間位置、運動狀態(tài)差異而承擔不同功能。

解析上述異質性的核心挑戰(zhàn)在于技術手段的缺失——傳統(tǒng)群體測量方法（例如熒光探針比率成像）只能提供細胞器群體的平均pH值，無法揭示單溶酶體水平的動態(tài)差異；而基于單分子定位的超分辨成像雖能追蹤單個溶酶體的運動與形態(tài)，卻難以同步測試腔內pH。徐兆超團隊此前開發(fā)的LysoSR-549探針（Angew. Chem. Int. Ed.，2022）和Aze-HMSiR（Angew. Chem. Int. Ed.，2025），可通過pH依賴的自發(fā)閃爍特性，在單溶酶體水平關聯(lián)動態(tài)行為與相對pH變化。然而，其依賴單色熒光光子數(shù)的測量方法易受實驗條件（如激發(fā)光強度、探針負載量）等環(huán)境因素影響，導致單個溶酶體中pH測量不夠準確。

在本工作中，研究團隊發(fā)展的2C-SMBR技術基于兩種pH響應特性互補的自發(fā)閃爍熒光探針：通過單分子定位顯微術（SMLM）分別解析兩種探針的空間分布，可重建溶酶體的納米級結構（分辨率10nm）；同時，利用雙色探針閃爍動態(tài)的比率分析（如頻率、持續(xù)時間等參數(shù)），消除探針濃度、光漂白等干擾因素，實現(xiàn)單溶酶體pH的精準定量。該技術將單分子定位的超高空間分辨率與比率分析的抗干擾性相結合，傳統(tǒng)方法依賴雙色信號的空間疊加，而2C-SMBR通過時間分辨的單分子事件關聯(lián)，確保信號源自同一溶酶體，從而在納米尺度上同步實現(xiàn)結構成像與功能量化。該技術pH測量動態(tài)范圍可擴展至4.0至6.0，為活細胞器功能異質性研究提供了兼具精度與可靠性的新工具。

團隊應用2C-SMBR技術，取得了一系列新發(fā)現(xiàn)：首先，溶酶體pH在單細胞水平呈現(xiàn)高度異質性，單個細胞內同時存在pH跨度達2.0的溶酶體亞群（pH=4.0至6.0），其中核周溶酶體平均pH為4.88，而外圍溶酶體平均pH達5.64，且高pH溶酶體運動速度更快、更易形成動態(tài)簇集；其次，溶酶體動態(tài)行為與pH變化存在實時耦合，單個溶酶體的pH實時發(fā)生動態(tài)波動，溶酶體運動停頓過程可能擔任溶酶體pH變化的拐點。此外，當細胞堿化后大部分外圍溶酶體會向核周中心體附近聚集形成新的亞群。

相關研究成果以“Two-Color Single-Molecule Blinking Ratiometricity: A Functional Super-Resolution Imaging Approach for Resolving Lysosomal pH and Dynamics”為題，發(fā)表在《德國應用化學》（Angewandte Chemie International Edition）上。該工作的第一作者是我所1818組喬慶龍副研究員。上述工作得到國家自然科學基金、中國科學院穩(wěn)定支持基礎研究領域青年團隊計劃、我所創(chuàng)新基金等項目資助。（文/圖 喬慶龍、徐兆超）

文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202503916